ÖZET

Anjiyogenez; fetal gelişim, ovulasyon ve yara onarımı sırasında var olan kan damarlarından yeni kan damarları oluşturma sürecine verilen addır. Tümör oluşumu ve gelişimi, tümör hücrelerinin metastazik yayılım yapabilmesi adına tümör anjiyogenezi vasıtasıyla dolaşım sistemine karışmasından ileri gelir. Kendilerini yenileyebilme ve çoğalma kapasitelerinin yanı sıra, kanser kök hücreleri (CSCs) tümör anjiyogenezinde de rol sahibidir. CSCs, tümörlerin etrafındaki neovasküleriteyi indüklemek için damar ile bağıntılı düzenleyicileri üreterek vasküler bir niş oluşturur. Antianjiyogenik faktörleri geliştirmek ve onların etkilerini 3 boyutlu (3D) sferoid anjiyogenez modelinde değerlendirmek, kayda değer kanser terapötik önlemlerdendir çünkü niş, CSCs ve heterojenite üçlüsünün birbirleriyle olan ilişkileri 3D sferoid kullanılarak daha net bir şekilde saptanabilir. Dahası, farmakolojik güvenlikleri ve antikanser etkilerini göstermek için kullandıkları moleküler yolaklar sebebiyle bitkisel kimyasalların antianjiyogenikliğini işlemek, diğer geleneksel ilaçlara göre daha avantajlıdır. 

ANAHTAR KELİMELER

Kanser kök hücreleri / Vasküler niş / Bitkisel kimyasallar / Sferoid / Antianjiyogenez

KISALTMALAR

ANJİYOGENEZ

Anjiyogenez karmaşık bir süreç olup endotelyal hücrelerin aktivasyonu, çoğalması ve var olan kan damarlarından yeni kılcallar oluşturmak için yönlendirilmiş göç olaylarını içerir [1]. Bu durum; gelişim, üreme ve yara onarımı gibi çeşitli fizyolojik süreçlerin bir parçasıdır [2]. Anjiyogenez ayrıca kanser, römatoid artrit, psoriasis ve proliferatif retinopati gibi patolojik durumların varlığında da pay sahibidir [3]. Çözünebilen polipeptitler, hücre-hücre ile hücre-matriks etkileşimleri ve hemodinamik etmenler gibi çeşitli faktörler anjiyogenezi etkiler. Anjiyogenezi indükleyen bazı uyaranlar VEGF ailesi, anjiyopoietinler, TGF, PDGF, TNF-α, interlökinler ve FGF ailesinin üyeleridir [4, 5]. Bunların arasında; VEGF-A, çoğalma, filizlenme ve endotelyal hücrelerin tüp biçimlenimi için tetikleyici olma konusunda en ideal proanjiyogenik proteindir. Hipoksik koşullar altında, VEGF, kendisinin endotelyal hücrelerdeki tirozin kinaz reseptörlerine (VEGFRs) bağlanır ve sinyal iletim yolaklarını uyararak ilgili hücrelerin anjiyogenez için filizlenme sürecine girmesini tetikler [6, 7].

• Tümör Anjiyogenezi

Anjiyogenez, tümör hücrelerinin dolaşım sistemine karışmasını sağlayıp premetastatik vasküler niş oluşturduğu için tümörlerin metastatik yayılımında kilit bir rol oynamaktadır [8]. Tümörler gelişim gösterdikçe malignant bir huy kazanır ve hipoksik koşullara tutunur. Oksijen kıtlığı durumu (hipoksia / hipoksik koşul), anjiyogenik büyüme faktörlerinin salınımını indükler. Proanjiyogenik sinyallerin bu artışı, anjiyogenik dönüşüme neden olur. Büyüme faktörlerinin kendisine yakın olan kan damarlarının endotelyal hücre reseptörlerine bağlanması, tümörlerin istilasını ve gelişim sürecini yönlendirir [9] (figür 11.1). Tümör anjiyogenezi sırasında oluşturulan yeni damarlar, normal damarlardan duvarlarının hem tümör hücrelerinden hem de ECs’den oluşması bakımından farklılık gösterir [11]. Periferal kan damarlarının genellikle işlevsel perisitlerden mahrum olması sebebiyle [12] bazal membrana delikli bir görünüm kazandırarak bu zarın genişleyen ve tamamlanmamış bir yapı olmasına neden olur [13]. Normal anjiyogeneze analog olarak, tümör anjiyogenezi de tümör vasküleritesinin devamlılığı için VEGF ve diğer anjiyogenik proteinlerin varlığına ihtiyaç duyar. VEGF ve reseptörü olan VEGF-2’nin üretiminin artması, tümör vasküleritesini tetikleyen metastatik insan kolon karsinoması gibi birçok kanser türünde rapor edilmiştir [14]. Anjiyopoietin-2 (Ang-2), normal damarlardan ziyade tümör damarlarının ECs’nde daha çok üretilmektedir. Bu durum VEGF varlığında plastisiteyi artırdığı gibi tümör anjiyogenezinin başlangıç seviyelerinde önemli bir rol oynar [15, 16]. TGF-β sinyalleri, tümör büyümesini ve neoplastik hücreler sayesinde stromal hücrelerini indükleyerek metastazı tetikler ve anjiyogenez ile tümörün ilerlemesine neden olur [17-19]. 

Figür 11.1 Tümöral anjiyogenez. Basamak basamak ilerleyen anjiyogenez, ECM ve BM yıkımıyla başlar, EC çoğalması ve göçüyle devam edip kan damarlarının oluşumuyla son bulur. Tümör hücreleri ise yeni kan damarlarının tümör dokunuyu beslediğinden emin olmak için çeşitli faktörler salgılar [10]. 

KANSER KÖK HÜCRESİ (CSC) VE ANJİYOGENEZ

CSCs, kendilerini yenileme ve çoğalma kapasitelerinin yanı sıra tümör anjiyogenezinde de pay sahibidir. CSCs, tümörlerin etrafındaki neovasküleriteyi indüklemek için damar ile bağıntılı düzenleyicileri üreterek vasküler bir niş oluşturur [20]. Tümör heterojenitesi, tümör mikroçevresi ya da nişi denilen temel bir faktör tarafından dış uyaranlarla kontrol edilir. Bir niş; stromal, immün, endotelyal ve kanser hücreleriyle birlikte bağ doku elemanları, büyüme faktörleri ve sitokinlerden oluşur [21]. Devamlılıkta, zenginleştirmede, fenotipik plastisitenin korunmasında, immün kontrolde, farklılaşmalarda, anjiyogenez aktivasyonunda ve CSCs’nin istilası ve metastazında elzem görevleri vardır [22-24]. Bu yüzden, CSCs ve anjiyogenez pozitif geri bildirim gösterir ve tümör anjiyogenezine sebebiyet verir.

• CSC ve Anjiyogenezin Moleküler Etkileşimi

Normoksik koşullarda da, hipoksik koşullarda da CSCs, CSC olmayan hücre gruplarına göre daha fazla VEGF üretir. Bu gibi CSC tarafından kontrol edilen VEGF üretimi, endotelyal hücre göçüne neden olurken in vitro ortamda tüp formasyonunu oluşturur (figür 11.2). Oluşturulan bu yeni damarlar, kanserin büyümesi ve gelişimi için besin temininden sorumludur [25]. Çeşitli çalışmalar, CSCs’nin anjiyogeneze yol açıp VEGF, SDF-1 ve tümör mikrovesikülleri aracılığıyla anjiyogenezi ileri seviyeye taşıyabileceğini ve vasküler niş ile iletişim hâlinde olan hücreleri üretebileceğini onaylamıştır [26-28]. Grange ve ekibinin yapmış olduğu bir çalışma göstermiştir ki insan renal hücre karsinomasındaki CSCs’nden türeyen mikrovesiküller, normal insan endotelyal hücrelerine anjiyogenik fenotip kazandırarak onların gelişimlerini ve damar formasyonunu destekleyen proanjiyogenik mRNA ve microRNA setlerini içinde barındırır.

Figür 11.2 CSC ve anjiyogenez etkileşimi

• CSC ve Anjiyogenez Arasındaki Sinyal Yolakları

Vasküler endotelyal hücrelerin CSC’nin çoğalmasını nasıl idame ettirdiğini anlamak için CSCs ve anjiyogenez arasındaki sinyal yolaklarını kavramak elzemdir. BMP sinyalleşmesi, kritik yolaklardan biridir. Asıl olarak kemik biçimlenmesindeki göreviyle bilinen BMP, anjiyogenezin inhibisyonunda da rol sahibidir. BMP-9, VEGF üretimini ve anjiyogenezi poizitif yönde değiştiren TGFβ/ALK5 yolağının etkilerine karşı direnç oluşturur. Dolayısıyla; BMP-9/ALK1, BMP-9 vasıtasıyla VEGF üretimini baskılar ve anjiyogenezi inhibe eder. BMP-4 ise bu iki yolağı dengede tutup vasküler bütünlüğü korumakla görevlidir [29]. BMP-4 aynı zamanda, glioblastoma kanser kök hücrelerinde BMP-4/BMPR/SMAD sinyal yolağı aracılığıyla antitümörojenik etki göstermesiyle de bilinmektedir [30].

CSCs ve anjiyogenez ile iletişim hâlinde olan bir diğer yolak ise Notch sinyal yolağıdır. Vasküler gelişim ve normal kök hücrelerin hayati fonksiyonları Notch/NICD/Hes/Hey sinyal yolağı tarafından desteklenir [31, 32]. Araştırmalar göstermiştir ki glioblastomadaki CSCs’nin yenilenmesi ve anjiyogenez Notch yolağı tarafından da beslenir. Bu Notch yolağının DAPT (γ-sekretaz inhibitör) ile inhibisyonu, CD133+ tümör hücrelerinin sayısını ve CSCs’nin kendilerini yenileme yeteneklerini azaltır. CD105, CD31 gibi vasküler belirteçler ve von Willebrand faktörü de redüklenmiş ifadede pay sahibidir [33].

• Anjiyogenik Belirteç Üreten CSCs

Bu bölümde tümöral kan damar formasyonunu desteklemek için vasküler endotelyum belirteçlerini üreten çeşitli CSCs ele alınmıştır. Nestin+/CD133+ beyin kanseri (oligodendroglioma ve glioblastoma) kök hücreleri, endotelyal hücreler ile yakından ilişkilidir ve CSCs’nin kendilerini yenileme mekanizmalarından sorumlu olan faktörleri temin eder. Dahası, bu kök hücreler CD34+ kılcallarına yakın mesafelerde konumlanır ve MVD’nin oluşmasına katkı sağlar [34]. Bao ve ekibinin malignant gliomalar üzerine yapmış oldukları bir çalışmada, CD133+ bakımından zengin kök hücre benzeri glioma hücrelerinin (SCLGC) kan damarlarına yakın yerleşim gösterdiği saptanmıştır. CD133+ SCLGC tarafından desteklenmiş tümör vasküleritesi, nekroz ve hemorajın; CD133- SCLGC ile kıyaslandığında, VEGF üretimini 10-20 kata kadar artırdığı ve vasküler derişimi kayda değer bir şekilde yoğunlaştırdığı aşikârdır [25]. Yang ve ekibinin 2010’da hepatoselüler karsinoma üzerine yapmış olduğu bir çalışmada, MVD ile VEGF ve PD-ECGF gibi anjiyogenik faktörlerin; yüksek hepatik kök/öncül hücre (HSC/HPC) profil grubunda (CD133, nestin, CD44 ve ABCG2), düşük olana göre oldukça fazla üretildiği gözler önüne serilmiştir. Gliomik koşullar altındaki tümörlerde, büyük CSC popülasyonu, endotelyal öncül hücreleri (EPC) yoldan çıkararak onlar sayesinde VEGF ve SDF-1 üretiminin tetiklenmesine neden olur. Böylece yerel anjiyogenez oluşur ve EPC kontrol altına alır. Bu veriler kısmen de olsa kanser kök hücrelerinin kanser mikroçevresine anjiyogenik faktörlerin salınımını desteklemesini uyararak tümör anjiyogenezini indüklediğini gösterir (tablo 11.1). 

Tablo 11.1 Anjiyogenik belirteçler üreten CSCs

TERAPÖTİK ÖNLEM OLARAK CSCs’NİN HEDEFLENMESİ VASITASIYLA ANTİANJİYOGENİK TERAPİ

Tümör mikroçevresini düzenleyen tümör vaskülatürü, aynı zamanda kök ve öncül hücre formasyonunda da görev alır [35]. Tam da bu sebepten dolayı, anjiyogenez inhibitörleri sadece damar oluşumlarını bozmakla kalmayıp tümör anjiyogenezinde rol sahibi CSCs’ni de hedef alır (figür 11.3). Bevacizumab, thalidomide, sorafenib, sunitinib ve pazopanib gibi antianjiyogenik faktörler vasküler nişi hedef almanın yanı sıra CSC mikroçevresinin hareketlenmesine neden olur [36] (figür 11.3). Beyin kanserini tedavi etmede kullanılan antianjiyogenik terapi; tümör vaskülatürünü inhibe eden, CSC vasküler nişine kısmen de olsa zarar veren ve kendilerini yenileyen kanser kök hücrelerini ortadan kaldıran vasküler endotelyal büyüme faktörünü (VEGF) hedef alır [34]. Bir antikanser ilaç olan celecoxib, CSCs için sitotoksiktir. Antikanser özelliğini COX-2/PGE2/VEGF ve WNT/LGR5 kök yolaklarını inhibe ederek gösterir. COX-2, tümör ve stromal hücreler tarafından salınan prostanoid PGE2’yi üretir. PGE2 ise kanser kök hücreliliğini ve anjiyogenezi VEGF ve FGF üretimi vasıtasıyla canlandırmak için otokrin/parakrin tarzında prostanoid reseptör ailesinin (EP1-4) hücre yüzey üyelerine bağlanır [37]. Bahsedilen tüm bu bulgular, CSCs’ni hedefleyen antianjiyogenik faktörlerin geliştirilmesinin, önemli bir kanser terapötik önlem olduğunu gözler önüne sermektedir. Bu tarz bir terapi ile bir taşla iki kuş vurulmuş olur: tümörleri vasküler beslemeden mahrum bırakmak ve tümör kitlesini bozarak tümörün nüksetmesini önlemek.

Figür 11.3 CSCs’ni ve tümör anjiyogenezini hedef alarak antianjiyogenik tedavi

• Bitkisel Kimyasalların CSCs’ni Hedeflemede Potansiyel Terapötik Olarak Kullanılması

Fitokimyasallar (bitkisel kimyasallar), bitkilerden elde edilen doğal biyoaktif bileşikler olup kemo-önleyici ve kemoterapötik uygulamalar için birebirdir. Fitokimyasalların ayrıca, CSCs’nin devamlılığı için hayati olan sinyal yolaklarına da müdahale ederek CSCs’nin fenotiplerini de düzenlediği rapor edilmiştir [38]. Siklopamin, ilk olarak mısır zambağında bulunmuştur, hedgehog sinyal yolağını hedef alırken [39-42] EGCG Wnt/-katenin yolağını [43-45], retinoik asit ise Notch sinyal yolağını [46, 47] inhibe eder. Bu sinyal yolakları ise CSCs’nin kendilerini yenileme, farklılaşma ve invazif yeteneklerinden sorumludur. Bunlara ek olarak; zerdeçal (kurkumin) ve uzun biberden (piperin) elde edilen fitokimyasallar, Notch ve/veya Wnt/-katenin sinyallerini inhibe ederek meme CSCs’ni hedef alıp antikanser etki göstermesiyle bilinmektedir [48]. Tüm bu kanıtlara dayanarak, fitokimyasalların kanser hücrelerine olduğu kadar CSCs’ne karşı da yararlı olduğu su götürmez bir gerçek olduğu gözler önüne serilmektedir. Tüm bu verilere rağmen, CSCs’nin anjiyogenik belirteçler üretmede fitokimyasalların rolü hakkında çalışma yapılmış değildir. Bu yüzden, gelecekteki araştırmaların bu konu üzerinde yoğunlaşması, fitokimyasalların diğer ilaçlara göre hâlihazırda tüketilebilen doğal bitkilerde var olması ve görece farmakolojik açıdan daha güvenilir olması sebebiyle elzemdir. Dahası, bu bitkisel kimyasallar birçok moleküler yolağı hedef alarak antikanser özellik gösterir. 

ANJİYOGENEZDE SFEROİD MODELLER: VASKÜLER NİŞ VE CSCs

Niş, CSCs ve heterojenite üçlüsünün birbirleriyle olan ilişkileri, sferoid 3D sferoid model kullanılarak daha rahat özümsenebilir. 3D sferoidler; uzamsal boyutları, hücresel heterojeniteyi ve tümör mikroçevresinin moleküler yolaklarını canlandırır. İleri seviye 3D modeller, CSCs’ni anlamak adına in vivo mikroçevre için daha uygun koşullar sağlar. In vitro sferoid biçimlenme yeteneği ise CSCs’nin işlevselliğini kontrol etmede bir kriter olarak kullanılır çünkü CSCs’nin, sferoid cisimcikler gibi, çoğalmaya eğilimleri vardır [49]. Sferoid modellerin in vivo kanser mikroçevresini taklit ediyor olmasından dolayı herhangi bir antikanser ilacın 2D tek katmanlı kültürlerden ziyade 3D sferoid modellerde test edilmesi hayatidir. Bu yüzden de herhangi bir antianjiyogenik ilacın anjiyogenez sferoid modelleme üzerinde antianjiyogenik özelliğinin test edilmesi gerekmektedir ki kan damarlarındaki filizlenmeyi (tüp formasyonu) ve kanser kök hücreliliğinin bir işareti olan sferoid gelişimi inhibe edip edemediği anlaşılsın.

• Filizlenen Sferoid Temelli 3D Anjiyogenez Model

Endotelyal hücrelerin, fibroblastların (Endotelyal hücrelerle direkt bağlantısı olan fibroblastlar in vitro tüp formasyonu için elzemdir.) ve tümör hücre katmanının eş zamanlı kültürlenmesine dayanan bir 3D sferoid sistem, kanser-stromal ilişkiler ile tümörik anjiyogenez koşullarını taklit eder. Bu model sistemi, 2D monokültür ve in vivo sitemler arasındaki boşluk için bir köprü maiyetinde olup 3D in vitro tümör modellerinde çeşitli anjiyogenik ilaçların verimliliğinin test edilmesinde potansiyel bir platform olarak yerini alır [50].

 Eş zamanlı bir 3D sferoid sistem, 96 bölmelik U hücre kültür plağının her bölmesine HUVECs, fibroblast ve tümör hücreleri eklenerek üretilir. Bu hücreler 37 ℃’de bir gece bırakıldıktan sonra sferoid gelişim gösterirler. Oluşan bu sferoidler ise daha sonra tip1 kollajenle sarılmış 24 bölmeli bir plağa aktarılır. Anjiyogenez inhibitörleri eklenir ve sferoidlerin filizlenmesi için 37 ℃’de 2 gün bırakılır. Tip1 kollajenlerin içinde inkübe olmuş sferoidler kılcal benzeri oluşumlar göstererek tümör anjiyogenezinin başlangıç seviyesini taklit eder. Bu anjiyogenik filizlenme, faz kontrast mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Filizlenmelerin sayısı ve her birinin uzunluğu (ortalama ve toplam), analiz edilmesi gereken önemli parametrelerdendir. Ayrıca, sferoid hücreler, ilaç tedavisiyle değişmiş anjiyogenik ve CSC belirteçlerinin tespit edilmesi için FACS kullanılarak ayrıştırılabilir [51] (figür 11.4).

Figüre 11.4 Anjiyogenez sferoid model

BAKIŞ AÇILARI VE GELECEK PLANLAMASI

Kanser kök hücresi biyolojisi alanında yıllardır yapılan çalışmalar sayesinde önemli eşikler aşılagelmiştir. Bu bölümde ele alınmış olan kanıtlar, CSC popülasyonunu hedef alan antianjiyogenik fitokimyasalların önemini gözler önüne sermiştir. Antikanser ilaçların geliştirilmesindeki kılcal filizlenme mekanizmasını ve tümör mikroçevresinin kanser kök hücreliliğini taklit eden in vitro anjiyogenez sferoid model uygulamaları, gelecek yıllardaki kanser terapötikleri için yepyeni yollar açmıştır.

CSCs, anjiyogenez ve tümör vaskülatürü arasındaki iletişime dayalı klinik uygulamaları, tümör biyolojisinde antitümör etki oluşturmada yeni ufuklar kazandırmıştır. Antianjiyogenik terapiyi ve anti-CSC terapiyi harmanlamak, hâlihazırdaki kanser terapilerinin verimliliğini artıracak yöndedir. Bunlara ek olarak, harmanlanmış bu tedavi yönteminin normal kök hücreleri en az düzeyde etkilemesi veya hiç etkilememesi gerektiği akıllardan çıkarılmamalıdır. Ayrıca, fitokimyasalların CSCs’nin anjiyogenik belirteç ifadelerindeki rolleri üzerine çalışmalar yapılmadığı için gelecekteki araştırmaların bu konu üzerinde yoğunlaştırılması önemlidir.

CSCs, genellikle epitelyal-mezenkimal dönüşüm (EMT) gösterirler. EMT ise bir proanjiyogenik faktör olan VEGF-A’nın ifadesini düzenler. Geçtiğimiz yıllardaki çalışmalar, CRISPR/Cas teknolojisi kullanılarak EMT yolağının tasvir edilmesinin üzerinde durmuştur. Bu yüzden alternatif bir yaklaşım olarak, gelecekteki araştırmaların tümör yığınını hafifletmek amacıyla CSC bağıntılı genleri ifade eden EMT’yi hedef alan CRISPR/Cas9 gen edit teknolojisinin üzerine yoğunlaşması beklenmektedir.

KAYNAKÇA: Cancer Stem Cells: New Horizons in Cancer Therapies, Editörler: Surajit Pathak Antara Banerjee